GECH, Grupo Español de Citologia Hematologica

TRATAMIENTO Y EVOLUCIÓN

PACIENTE Y MÉTODOS

Paciente de 88 años diagnosticado en 1991 de LLC de célula B (LLC-B) estadio A de Binet, cuyo inmunofenotipo y morfología era, en el momento del diagnóstico, típico de LLC-B (CD19+/CD5+/FMC7–/CD22–/CD23+/sIg–) (figura 1).

Se mantuvo en abstención terapéutica hasta julio de 1995, momento en que inició tratamiento por progresión clinicobiológica con clorambucilo intermitente (0,4 mg/kg 2 días cada 15 días). Desde entonces recibió esta pauta terapéutica en diferentes ocasiones, discontinuándola cuando alcanzaba respuesta clínica.

En marzo del 1999 ingresa por progresión clinicobiológica con astenia y fiebre de 2 semanas de evolución.

El Hemograma reveló Hb: 85 g/l, leucocitos: 94,2 × 10⁹/l y plaquetas: 151 × 10⁹/l.

Bioquímica sérica. El nivel de LDH (2.185 U/l, N < 460) y B2-microglobulina (4,8 mg/l, N < 2,5) estaban elevados.

En los frotis de sangre periférica y médula ósea se objetivaron dos poblaciones morfológicamente diferenciadas (figuras 2A y 2B): el 80% eran blastos de pequeño tamaño con elevada proporción núcleo/citoplasma, y el 15% eran linfocitos maduros, con características morfológicas de LLC.

El estudio inmunofenotípico de sangre periférica confirmó la presencia de dos poblaciones celulares una con fenotipo de LLC y otra con fenotipo de LLA pro-B (ver más adelante), que suponían el 22 y el 63% de la celularidad, respectivamente (muestra LLA1) (figura 3).

Ante estos hallazgos se establece el diagnóstico de crisis blástica linfoblástica en paciente con LLC iniciando tratamiento con vincristina y prednisona semanal.

A los 15 días del tratamiento el estudio fenotípico de sangre periférica revela una disminución porcentual de la población inmadura (2,7%) con incremento de la población con fenotipo de LLC (76%) y a las 4 semanas se observó una desaparición de la población inmadura (fenotipo de LLC y LLA del 80 y 0% de la celularidad total, respectivamente [muestra LLC1]).

En abril de 1999 se introduce al tratamiento ciclofosfamida y en mayo inicia tratamiento de mantenimiento con metotrexato y 6-mercaptopurina.

En noviembre del 1999 ingresa por neumonía bilateral falleciendo a los 4 días de su ingreso.

Inmunofenotipo y purificación celular: el estudio inmunofenotípico se realizó empleando un citómetro de flujo FACScan (Becton/Dickinson, Biosciences San José, CA, USA) utilizando las siguientes combinaciones triples de AcMo (FITC, PE, PerCP o PE-Cy5): cMPO/cCD79a/cCD3, nTdT/cIgM/cCD3, CD4/CD8/CD3, CD7/CD5/CD3, CD19/CD34/CD45, CD10/CD13/CD19, CD5/CD33/CD20, CD65/CD2/HLA-DR, CD34/CD38/CD19, CD10/ CD20/ CD19, CD7/CD2/CD3, CD34/CD22/CD19, y TdT/CD10/CD19, FMC7/CD5/CD19; CD22/ CD23/CD19; CD103/CD25/CD19; CD10/CD11c/ CD19; (sIg)kappa/(sIg)lambda/CD19.

Todos los AcMo fueron adquiridos a Becton Dickinson, excepto CD34 PE-Cy5 y FMC7-FITC (Immunotech, Marseille, France) y CD19 PE-Cy5, CD33 PE-Cy5, CD13 PE-Cy5, CD4 PE-Cy5, CD65 FITC, CD45 PE-Cy5, y CD20 PE-Cy5 (Caltag Laboratories, San Francisco USA).

La separación celular de las dos poblaciones identificadas en la muestra de sangre periférica (LLA1) se realizó mediante cell sorting en un citómetro de flujo FACS Vantage identificando la población correspondiente a la LLA gracias a la expresión de CD34 y la correspondiente a LLC gracias a la coexpresión de CD19 y CD5. Se obtuvieron un total de 5 × 10⁶ células blásticas y un total de 1 × 10⁶ células de LLC, con una pureza en ambos casos superior a 98%.

Extracción de ADN y Southern blot: la obtención de ADN de alta calidad se obtuvo a partir de muestras de sangre periférica sin separar (poblaciones LLA1 y LLC1) así como en poblaciones celulares separadas mediante digestión con proteinasa K y extracción con fenol/cloroformo. Para realizar el análisis de Southern blot de los genes de Ig, el ADN se digirió con 4 combinaciones diferentes de enzimas de restricción, en 4 reacciones separadas (BglII, BamHIHindIII, HindIII y XbaI). Posteriormente, el ADN digerido se transfirió a una membrana de nailon y fue hibridado con las siguientes sondas: IGHJ6, correspondiente a los genes de las cadenas pesadas de Ig (IGH), IGKJ5, IGKC e IGKDE, para la cadena ligera kappa de las Ig (IGK) y, por último, IGLJ2 y IGLC1D para la cadena ligera lambda (IGL).

PCR y secuenciación: los reordenamientos de IGH e IGL fueron amplificados en ADN obtenido de las muestras de sangre periférica, así como en ADN procedente de células purificadas de LLC y LLA, utilizando los primeros y los protocolos diseñados durante el estudio del BIOMED-2. En concreto se amplificaron por PCR los reordenamientos VDJH y DJH del locus de IGH, y los reordenamientos VJK y KDE del locus de IGK. Los productos de PCR obtenidos se analizaron en un gel de poliacrilamida y las bandas clonales se aislaron para la posterior extracción y secuenciación directa del ADN. Las secuencias obtenidas fueron comparadas con las procedentes de segmentos V, (D) y J germinales de las principales bases de datos de los genes de Ig. El análisis de la distribución de mutaciones reemplazantes (R) y silentes (S) se realizó de acuerdo con el modelo de distribución binomial propuesto por Chang y Casali.

DISCUSIÓN DEL CASO

El análisis por citometría de flujo de la muestra LLA1 (muestra al diagnóstico de LLA sin separar) mostró la presencia de dos poblaciones tumorales perfectamente definidas (tabla 1) (figura 3).

Un 22% de la celularidad total estaba representado por linfocitos pequeños con fenotipo de LLC (CD19+, CD5+, CD23+, CD20+), mientras que otro 63% de las células eran blastos con un patrón inmunofenotípico característico de una LLA de fenotipo pro-B (CD19+, CD34+, CD10–, CD20–, TdT+), con expresión aberrante de los antígenos mieloides CD13 y CD33 (figura 3).

La tabla 2 muestra los resultados obtenidos mediante Southern blot.

Un patrón idéntico de reordenamientos de IGH fue obtenido en las muestras LLA1 y LLC1, ambas presentando reordenamientos bialélicos de JH de igual tamaño (figura 4).

El análisis de IGK fue realizado solamente en la muestra LLC1, y mostró la presencia de dos reordenamientos de VJK potencialmente funcionales, mientras que el locus de IGL mantenía una configuración germinal (tabla 2).

Aunque la proporción relativa de células tumorales provenientes de LLA y LLC era distinta en las dos muestras (63 frente a 22% en LLA1 y 0 frente a 80% en LLC1, respectivamente), el porcentaje total de células tumorales era prácticamente idéntico (80-85%).

Por tanto, la intensidad relativa de las bandas reordenadas, comparadas con las germinales era similar y confirmó que el mismo patrón de reordenamientos de los genes de Ig estaba presente en las poblaciones de LLC y LLA (figura 4)

En resumen, el hallazgo de un único patrón de reordenamientos de los genes de Ig por Southern blot permitió demostrar el origen clonal común de ambas entidades. La amplificación por PCR de los reordenamientos de IGH, confirmó la presencia de los mismos reordenamientos en las muestras LLA1 y LLC1.

En concreto, tras secuenciar las dos bandas obtenidas por PCR, encontramos un reordenamiento completo (VH6/JH4) y un incompleto (DH5-18/JH4). Además, de acuerdo con el mapa de restricción de los diferentes genes, los tamaños de restricción esperados para estos reordenamientos coincidían con los encontrados por Southern blot con las diferentes enzimas de restricción. Tras comparar la secuencia del reordenamiento VH6/JH4 encontrado en ambas muestras con la secuencia germinal de VH6, se detectó un alto contenido de HMS (7%).

Para comprobar que dichas mutaciones provenían del proceso de HMS y no representaban la existencia de un polimorfismo, se secuenció el segmento VH6 germinal en linfocitos normales (CD3+) del mismo paciente que confirmó una homología del 100% con la secuencia germinal demostrando, por tanto, la existencia de HMS en las células clonales.

Interesantemente, al analizar las células purificadas de LLC y LLA, encontramos exactamente la misma distribución de HMS en los reordenamientos VH6/JH4 y DH5-18/JH4 en ambas poblaciones, respectivamente.

Al analizar por PCR los genes IGK sólo pudimos amplificar un reordenamiento VJK en las poblaciones de LLC y LLA. La secuencia correspondía a un reordenamiento funcional VK4-1/JK2, conteniendo un 6% de HMS. El segundo reordenamiento de VJK que aparecía en el Southern blot no pudo ser amplificado mediante PCR, seguramente debido a la presencia de un alto grado de HMS en la región de unión de los primers de VK y JK.

En conjunto, todos los datos obtenidos tanto por Southern blot como por PCR en poblaciones purificadas de LLC y LLA, así como en muestras totales, demostraron un único patrón de reordenamiento de los genes de IGH e IGK.

La única explicación posible para este fenómeno es la existencia de un progenitor pretumoral común para ambas poblaciones, si bien, existen dos hipótesis divergentes para explicar tanto el origen como la evolución clonal de dicho progenitor.

La primera se basa en la similitud encontrada entre la evolución hacia crisis blástica ocurrente en este caso, y en otros descritos en la literatura, y la de los pacientes con LMC. En este caso, el progenitor común sería un precursor linfoide B CD34+ con sus genes de Ig ya reordenados que, a pesar de proliferar continuamente, todos sus descendientes se diferenciarían hacia células B maduras con fenotipo de LLC (CD19+/CD5+/CD23+). Dicho precursor, iría acumulando anomalías genéticas a lo largo del tiempo hasta que, en algún momento a lo largo de esta evolución, se produjese un bloqueo en la diferenciación de estas células hacia célula B madura, y comenzaran a acumularse linfoblastos en la médula ósea, cuya manifestación sería en forma de LLA. En favor de esta hipótesis estarían los datos moleculares encontrados en un subgrupo de células CD34+ procedentes de pacientes con LLC, en las que se puede observar el mismo tipo y patrón de alteraciones citogenéticas que en las células tumorales. Así mismo, el uso del segmento VH6 en reordenamientos VDJH suele encontrarse más frecuentemente en LLA que en LLC.

Una segunda hipótesis que no podemos descartar sería la de un progenitor común en forma de linfocito B maduro que ha atravesado el centro germinal, adquiriendo HMS, cuya proliferación daría lugar a una LLC con genes de Ig hipermutados. En este caso, la aparición de una LLA secundaria a LLC resultaría de un proceso de “desdiferenciación” de esta célula B madura en el que una sucesión de genes implicados en la diferenciación y el desarrollo celular serían reexpresados o silenciados, revertiendo así el proceso natural de diferenciación celular. Esta segunda hipótesis se basaría en la existencia, según nuestros resultados, de HMS en los genes de Ig no sólo en los linfocitos B, sino también en los linfoblastos CD34+. Estudios de los genes de Ig en LLA durante la última década han demostrado consistentemente la ausencia de HMS en linfoblastos CD34+, salvo raras excepciones, en las cuales la media del grado de desviación respecto a la secuencia germinal normalmente no supera el 2%, lo cual puede ser explicado por la existencia de polimorfismos en los segmentos V de los genes de Ig. Esta hipótesis también explicaría la escasa incidencia de crisis blásticas en LLC, comparada con la encontrada en pacientes con LMC.

Futuros estudios moleculares, tanto en células de pacientes con LLC como en linfocitos y linfoblastos normales, serían muy informativos con el fin de corroborar alguna de las hipótesis mencionadas anteriormente.

HISTORIA CLÍNICA

INTRODUCCIÓN

Pese a que la leucemia linfática crónica (LLC) de célula B es uno de los síndromes linfoproliferativos más comunes en el mundo occidental, y se ha estudiado extensivamente, el origen de la célula diana tumoral sigue siendo desconocido.

Aproximadamente un 10% de los pacientes con LLC desarrollan un linfoma de grado alto, normalmente un linfoma difuso de célula grande, lo que se conoce como síndrome de Richter. Estos casos representan un sistema muy interesante para investigar la historia natural de la LLC.

Los estudios moleculares en diferentes casos de síndrome de Richter han obtenido resultados variables. Así, en algunos casos se ha demostrado un origen clonal común, mientras que en otros el origen de ambas entidades no presenta ninguna relación.

También se han descrito, aunque más raramente, casos de transformación secundaria de LLC a mieloma múltiple, enfermedad de Hodgkin y leucemia linfoblástica aguda (LLA).

En los últimos años diferentes grupos han demostrado que el estudio de las mutaciones somáticas de los genes de las inmunoglobulinas (Ig) permite distinguir dos grupos de LLC con pronóstico muy diferente. Así la presencia de hipermutación somática (HMS) es característica de un grupo de LLC de buen pronóstico, con una esperanza de vida significativamente mayor que los pacientes con ausencia de HMS, incluso cuando se consideran únicamente pacientes en estadios iniciales de la enfermedad.

El proceso de HMS parece ocurrir de forma exclusiva durante la reacción de los centros germinales de los órganos linfoides secundarios, mientras que los linfocitos B que no han alcanzado los centros germinales presentan reordenamientos de Ig sin HMS.

Por ello, la hipótesis actual es que el origen de la célula diana tumoral es diferente para ambos grupos de LLC, siendo un linfocito B maduro con HMS el responsable del grupo con mejor pronóstico, mientras que los casos más agresivos, con Ig sin mutaciones, procederían de linfocitos B más inmaduros.

Un estudio reciente sugiere que la transformación clonal a síndrome de Richter sólo ocurre en casos de LLC sin HMS, mientras que la aparición de transformaciones secundarias no relacionadas puede ocurrir en casos con o sin HMS.

Al contrario que los síndromes linfoproliferativos B maduros, las células de la LLA presentan unas características fenotípicas y genotípicas clásicas de células B precursoras, incluyendo la expresión de CD34, la ausencia de Ig de superficie y la falta de HMS en los reordenamientos de los genes de Ig.

Se han descrito en la literatura médica casos esporádicos de transformación a LLA en pacientes con LLC, y en los pocos casos en los que existen datos moleculares, éstos han sugerido un origen clonal común de ambas entidades. Estos resultados sugieren una similitud con el proceso de crisis blástica que ocurre en pacientes con leucemia mieloide crónica (LMC), donde se ha demostrado que la célula diana tumoral causante de ambas leucemias es un precursor de célula B CD34+.

Sin embargo, los datos presentados en este trabajo indican que la historia natural de algunos casos de crisis blástica en LLC puede ser muy diferente y sugieren la existencia de un mecanismo de “desdiferenciación” a partir de células B maduras.